这个，没什么要求咯！两个都要切，顺序随你咯，同时切也可以啊，只要在将目的基因转移到载体质粒之前讲两个都切好就行了。而且切开是用酶的，先后不是很重要的。

第一，没有切开，设单酶切对照，确保两个酶都能起作用第二，质粒质量不好，导致切不开，可以试剂盒纯化第三，质粒量要控制好，不能太多，太多切不开；也不能太少，太少切开了也看不到第四，PCR存在假阳性、假阴...

能重组之后切口补全又还原成酶切位点啦

应该能的，没有酶切的载体有很大一部分是超螺旋的，会跑得比本来的大小快，酶切结束后就线性化了。你在做连接时加一个只加载体不加insert的对照，如果对照不长的话证明载体切得没问题。你就多做几个载体和Insert的比例，...

目的基因切两次，质粒切一次。实际操作中，由于种种条件，往往需要用到两种酶识别两种切割位点，所以是各切两次。不管怎么切，保证切完后目的基因两端的识别位点和质粒切口两端相同即可。

防止环状质粒发生自连现象；而如果要在质粒上插入目的基因，酶切位点就必须与质粒切开的位点处是相同的，否则无法将两者进行连接。酶切过程可以是一种酶先切，另一种酶再切；也可以两种酶同时对质粒酶切，通常影响不大。

如果切两个，质粒就断开了，切的更多的话，就不能用了。他们选择的性内切酶只切一个口，是因为质粒中只有一处这种性内切酶认准的切点。而且质粒是环状的，切一个，也便于连接新的DNA片段形成重组分子。

质粒切开比未切开小。单酶切后，质粒变为线形，相对没切的质粒电泳速度会有变化，跑胶发现比原始质粒变小。原始质粒，单切的两个条带一样大小，但是比原始质粒跑的慢，双切的如果有连入片段，就会是两条带，一小一大，...

可能是酶切过程中DNA降解了，如果是双切下来的片段很淡，可以看看切了多大的一段，太小的话容易弥散，或者没切开。双酶切省事，但是每次效率都很低，还不如单切后回收，再切一次来的好，多费不了2个小时。质粒存在于...

建议：首先电泳时要有原质粒作对照，这样你就可以确定跑得快的带是不是未完全切开的质粒了。其次想酶切完全，可延长梅切时间，看你的体系酶的量足够了，而且酶的量本身也不应大于1/10；只是不知梅切的时间。最后若是可以...